实验二：贫氘水（超轻水）对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用的实验研究报告

试验时间：2010.10-2011.01
送样单位：丹东云端飘雪超轻水生物有限公司
试验单位：辽宁中医药大学药学院
试验单位：辽宁中医药大学药学院
贫氘水对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用的实验研究报告 
1. 实验目的
观察单用贫氘水、环磷腺苷与贫氘水联合用药对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及其对胸腺指数、脾脏指数和体重的影响。
2. 实验材料 
2.1 实验动物 
ICR小鼠，SPF级，雌性，体重18～22 g，中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所提供。合格证号码：0202619。
2.2 肿瘤细胞株：小鼠H22肝癌腹水型肿瘤细胞株，引自中科院上海细胞中心。
2.3 实验药物 
　　注射用环磷酰胺（CPA）：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：10051521 （由于环磷酰胺水溶液仅能稳定2~3小时，故每日给药前现配）
贫氘水：由丹东云端飘雪超轻水生物工程有限公司提供；无色透明状液体。
2.4 实验试剂 
注射用水：山东鲁抗辰欣药业有限公司提供，批号20100617
生理盐水：沈阳志鹰制药厂，批号：10113002
3. 实验方法 
3.1 造模 
　　ICR雌性小鼠60只，采用盲法对小鼠接种H22肝癌腹水瘤液。选择腹腔接种瘤细胞后10d的小鼠颈椎脱臼处死，75%酒精中浸泡约3分钟，在无菌超净台中抽取乳白色腹水液，采用白细胞计数法细胞计数，以无菌的0.9%氯化钠溶液稀释，调整瘤细胞悬液浓度为1×107个/ml瘤细胞，每只小鼠右腋下接种0.2ml。
3.2 分组与给药 
　　接瘤后的小鼠按照体重随机分为6组，每组10只，分为荷瘤模型组、贫氘水高、中、低剂量组、环磷酰胺组和环磷酰胺与氘水联合用药组。接瘤后24小时用药。荷瘤模型组腹腔注射注射用水（20ml/kg）；氘水高、中、低剂量组分别按照20ml/kg、10ml/kg、5ml/kg的剂量腹腔注射所提供的贫氘水原液；环磷酰胺组（CPA）腹腔注射注射用水溶解的环磷酰胺（20ml/kg，20mg/kg）；环磷酰胺与贫氘水联合用药组（CPA+贫氘水）腹腔注射贫氘水溶解的环磷酰胺（20ml/kg，20mg/kg）。均连续给药8天，每天一次。所有鼠均自由摄食饮水。
3.3 取材
　　最后一次给药后24小时（即第9天）将小鼠颈椎脱臼处死，称重；剥离瘤块，用滤纸吸干后称重；取出小鼠脾脏和胸腺，用滤纸吸干后称重。取材结束后用相机拍照记录各组小鼠的瘤块、脾脏和胸腺情况。
3.4 评定指标： 
（1）肿瘤抑制百分率（抑瘤率）： 抑瘤率（％）＝（模型组瘤重—给药组瘤重）/ 模型组瘤重 × 100
（2）比较各组小鼠实验过程中体重的变化情况；
（3）胸腺指数、脾指数：
胸腺指数（mg/10g）=胸腺重（mg）/ 体重(g) × 10
脾脏指数（mg/10g）=脾脏重（mg）/ 体重(g) × 10
3.5 统计学方法 
采用SPSS17.0统计软件进行One-wayANOVA分析及Excel软件进行作图。
4. 实验结果 
4.1 贫氘水对H22荷瘤小鼠瘤重的影响 
　　如图1所示，与模型组相比，环磷酰胺组、环磷酰胺+贫氘水组和贫氘水高、中、低剂量组的瘤重均有显著性差异（P<0.01）；与阳性药环磷酰胺组相比，环磷酰胺与贫氘水联合用药组无显著性差异(P>0.05)，而模型组和贫氘水高、中、低剂量组的瘤重均有显著性差异(P<0.01)。各给药组的抑瘤率见表1，图1-2。

*P<0.05, **P<0.01 与模型组相比

从图2瘤块照片中可以看出，模型组的瘤块最大，环磷酰胺组和环磷酰胺+贫氘水组与模型组相比，瘤块明显小很多；贫氘水高、中、低剂量组的瘤块与模型组相比也有所减少，但与环磷酰胺比较减少不明显。

图2 贫氘水对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用实验瘤块照片
4.2 贫氘水对H22荷瘤小鼠脾脏指数的影响
　　如图3所示，与模型组相比，环磷酰胺组、环磷酰胺+贫氘水组的脾脏指数有显著性差异(P<0.05)，贫氘水高、中、低三个剂量组无显著性差异（P>0.05）；与阳性药环磷酰胺组相比，模型组和氘水高、低剂量组均有显著性差异，环磷酰胺与贫氘水联合用药组无显著性差异。各给药组的脾脏指数见表2。由图4脾脏照片可见，环磷酰胺组和环磷酰胺+贫氘水组的脾脏较其它组明显变小，贫氘水高、中、低三个剂量组与模型组比较基本无变化。
 

*P<0.05, **P<0.01 与模型组相比；#P<0.05, ##P<0.01 与环磷腺苷组相比


图4 氘水对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用实验的脾脏照片
4.3 贫氘水对H22荷瘤小鼠胸腺指数的影响
　　如图5所示，与模型组相比，环磷酰胺组、环磷酰胺+贫氘水组的胸腺指数有显著性差异（P<0.01），贫氘水高、中、低三个剂量组无显著性差异（P>0.05）；与阳性药环磷酰胺组相比，模型组和贫氘水高、中、低剂量组均有显著性差异，环磷酰胺与贫氘水联合用药组无显著性差异。各组的胸腺指数见表3。
　　由图6胸腺照片可见，环磷酰胺组和环磷酰胺+氘水组的胸腺较其它组明显变小，贫氘水高、中、低三个剂量组与模型组比较基本无变化。
表3 氘水对H22荷瘤小鼠胸腺指数的影响（n=10， ±S.E.）

环磷酰胺+氘水组 (20mg+20ml)/kg 13.59±2.24 * *P<0.05, **P<0.01 与模型组相比；#P<0.05, ##P<0.01 与环磷腺苷组相比 
图6 氘水对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用实验的胸腺照片
5. 结论 
　　参照陈淑云主编的《药理实验方法学》第三版，第1762页中的1.7疗效评价，其对实体瘤的疗效进行了评价，如下：
　　实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率表示，计算方法如下：
　　瘤重抑制率%=（1-各给药组的瘤重 / 模型对照组的瘤重）*100% 中草药抑制率大于30%，合成药大于40%，并经统计学处理有显著差别时，认为有苗头，需继续重复，连续3次，疗效稳定，则评价此药有一定疗效。
5.1 对瘤重影响的结果表明：与模型对照组（注射水）相比，贫氘水高、中、低三个剂量组均有显著差异，其抑瘤率分别为31.67%、37.28%和26.28%，均大于30%，低于40%，说明贫氘水有一定的抑瘤作用，但与广泛用于临床的阳性药环磷酰胺相比抑瘤作用不明显。
5.2 贫氘水高、中、低剂量组的胸腺指数和脾脏指数明显高于阳性药环磷酰胺组，且有显著差异；并且贫氘水各剂量组对胸腺和脾脏的影响与模型对照组无显著差异，表明其毒副作用明显小于环磷酰胺。
5.3 高剂量的贫氘水与环磷酰胺联合使用时的抑瘤作用以及对免疫器官和体重的影响与单独使用环磷酰胺时无显著差异。