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技术介绍

TECHNOLOGY INTRODUCTION 

实验四:样品抑菌试验检测报告

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样品抑菌试验检测报告


1.样品
样品1:贫氘水48.8ppm;样品2:贫氘水80.0ppm
2. 试验菌:
(1)革兰氏阴性菌
大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B) 44102] ;
铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)[CMCC(B) 10104] ;
(2)革兰氏阳性菌
金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)[CMCC(B) 26003] ;
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63501] ;
(3)真菌
白色念珠菌(Monilia albican)[CMCC(F) 98001] 。
以上试验菌均为辽宁省药品检验所购置的标准菌株。
3.仪器及材料
YXQ.SG4b.280型手提式压力蒸气消毒锅 (上海医用核子仪器厂)
血细胞计数板 (上海求精生化试剂仪器有限公司)
KYC-111型空气恒温摇床 (上海福玛实验设备有限公司)
DPX-9052B-2型电热培养箱 (上海福玛实验设备有限公司)
SW-CT-2FD型超净工作台 (苏州安泰空气技术有限公司)
移液枪(20—200微升) (吉尔森技术有限公司)
96孔聚苯乙烯培养板、90mm培养皿,tip枪头、试管等
4. 培养基:
(1) 肉汤琼脂培养基组(g/L):
牛肉膏 3.0;
蛋白胨 10.0;
氯化钠 5.0;
琼脂粉 15.0;
水 1000ml,
pH 7.2,
0.1Mpa、20min高压蒸汽灭菌。
适用于铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌培养、检测。
(2)白色念珠菌琼脂培养基(g/L):(真菌类)
蛋白胨 5.0;
酵母浸粉 2.0;
K2HPO4 1.0;
葡萄糖 20.0;
硫酸镁 0.5;
琼脂粉 15.0;
水 1000ml,
pH 6.8,
0.1Mpa、20min高压蒸汽灭菌。适用于白色念珠菌的培养和检测。
(注:上述培养基不加琼脂粉即为相应液体培养基。)
5. 菌悬液的制备方法
  将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌接种到肉汤琼脂斜面培养基,将白色念珠菌接种到白色念珠菌琼脂斜面培养基上。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌在37℃培养18—24小时,白色念珠菌在28℃的恒温培养箱内有氧条件下培养24—28小时。分别向培养好的试管斜面中加入10ml无菌蒸馏水,用接种环刮下菌苔,倒入打碎装置中,充分振摇30min后倒入过滤装置,之后倒入无菌试管中制成菌悬液。用血细胞计数板在显微镜下计数。公式为:样品中菌(或孢子)数(个/ml)=每小格的平均数*稀释倍数*4* l06,用液体培养基将菌浓度调至l05 个/ml,白色念珠菌调至l03 个/ml备用。
6.液体微量法最小抑菌浓度(MIC)检测方法
  无菌操作,将相应检测用的液体培养基100μL加到灭菌的96孔聚苯乙烯培养板的每个小孔中,将样品100μL加到第1和第2孔中,第1孔为阴性对照,从第2个小孔吸取100μl放到第3个小孔,混合,进行2倍比例稀释,从第3个小孔吸取100μl加到第4个小孔中混合,依次稀释至所需浓度,再在不同的小孔中加入相应的试验菌菌悬液100μl,在一个小孔中不加药液,作为阳性对照。此时,从第2孔开始药物浓度分别为原液浓度的1/2,1/4,1/8,1/16,1/32,1/64……有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌的培养板在37℃培养18—24小时,白色念珠菌28℃培养24—28小时。
结果判断:以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔(即不含药物)内细菌明显生长试验才有意义。
7. 结果
  采用微量液体稀释法来测定样1和样2的最小抑菌浓度,结果见图1、图2和图3。样1和样2的最小抑菌浓度结果如表1所示。



1-2行加入大肠埃希菌(;3-4行加入金黄色葡萄球菌;
5-6行加入铜绿假单胞菌;7-8行加入枯草芽孢杆菌。
(第1个孔是阴性对照,第22个孔为阳性对照,每行样品共11孔,最后1行为空。)
图1. 样品1(48.8ppm)对四种细菌的最小抑菌浓度的检测



1-2行加入大肠埃希菌;3-4行加入金黄色葡萄球菌; 5-6行加入铜绿假单胞菌;7-8行加入枯草芽孢杆菌。
(第1个孔是阴性对照) 图2. 样品2(80.0ppm)对四种细菌的最小抑菌浓度的检测



2-4行检测样品2(80.0ppm);5-7行检测样品1(48.8ppm)
2-7行均加入白色念珠菌菌悬液
(第1个孔是阴性对照,第33个孔为阳性对照。)
图2. 样品1和样品2对白色念珠菌的最小抑菌浓度的检测
表1 样品最小抑菌浓度(MIC)测定结果表
 

试验菌

样1(48.8ppm)

样2(80.0ppm)

铜绿假单胞菌

P.Aeruginosa

大肠埃希菌

Escherichia coli)

金黄色葡萄球菌

Staphyloccocus aureus Rosenbach

 

4096倍稀释

 

32768倍稀释

枯草芽孢杆菌

Bacillus subtilis

2倍稀释

32768倍稀释

 

白色念珠菌

Monilia albican


注:1.试验重复两次,结果无显著性差异。
2. “—”表示原液的二倍稀释液无抑菌性。
8.结果分析
(1)样品1(48.8ppm)和样品2(80.0ppm)对革兰氏阳性菌如:金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有较强的抑菌作用,对检测菌中的革兰氏阴性菌如:铜绿假单胞菌和大肠埃希菌无抑菌作用,对真菌中的白色念珠菌无抑菌作用。
(2)样品2(80.0ppm)对革兰氏阳性菌的抑菌作用明显强于样品1(48.8ppm)。
9. 附图



图4 超净工作台及用品 



图5 96孔培养板及五种试验菌菌悬液



图6 操作过程中的一些用品