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技术介绍

TECHNOLOGY INTRODUCTION 

实验五:低氘水对小鼠免疫调节作用的研究

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低氘水对小鼠免疫调节作用的研究


氢原子有 3个核素: 质量为 1的氢 (H ) , 即氕 , ; 质量为 2的重氢 ( D ), 即 氘 ; 质量为 3的超重氢( T) ,即 氚 。其中氢与氧元素结合生成轻水(H2O ), 氘或氚与氧元素结合生成重水 ( D2O )。自然界的水中氘的体积分数为 0 . 015 %,
[ 1 ]而低于这个体积分数的水就称为低氘水。早在 1974年,重氢就被研究其对于人的衰老以
及健康的作用。过高浓度的重水会显著减少小鼠存活时间, 这可能和其导致有丝分裂过程的停滞有关
[ 2]。也有理论认为重氢可以改变参与 DNA 反应的酶分子的形状,从而影响生命过程的正常进行,引发各种疾病。而 25 % ~ 35 % 的重水却表现出一定的抗肿瘤特性,抑制肿瘤生长, 延长小鼠存活期,且该浓度范围的重水可使实验组小鼠接受 Co辐射的致死率显著少于对照组[ 3 , 4]。富含氢的水也可促进糖脂代谢,从而预防和延迟胰岛素抵抗和!型糖尿病[ 5]。低氘水的研究非常少,我项目组率先在国内进行这方面的探索。先在体外用 0 . 0025 %, 0 . 0050 %
和 0. 0105%体积分数的低氘水对 A549和 HLF- 1细胞进行培养, 结果显示相比正常培养液, DDW 对肺癌细胞增殖有抑制作用, 而对正常细胞的生长无显著抑制,其中以 0 . 0050 %浓度效果最明显。利用流式细胞仪检测其细胞周期,推测可能是由于 DDW将肿瘤细胞阻滞在 S期, 且促进肿瘤细胞凋亡而达到抑制癌细胞的恶性增长。体内试验也同样证明了DDW 的抑瘤作用[ 6]。同时低氘水对于衰老模型小鼠的抗氧化能力也有一定正向调节作用,它可以提高超氧化物歧化酶 ( SOD ) , 谷胱甘肽过氧化物酶( GS H - Px)含量,增加 N a- K - ATP酶活力和总抗氧化能力( T- AOC) ,降低单胺氧化酶(MAO ) ,丙二醛(MDA )的含量。本实验从多方面研究 0 . 0050 %的 DDW对正常小鼠免疫调节的影响。

1 材料与方法
1 . 1 试剂和试验动物
0 . 0050 %的低氘水, 由上海交通大学生命科学技术学院提供。实验所需试剂及试剂盒均由上海达为科生物科技有限公司提供。清洁级 I CR 纯系雄性小鼠,体质量( 20 ∀ 2) g , 由中国科学院上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。
1 . 2方法
1 . 2. 1动物培养: :将 16只 ICR雄性小鼠随机分成 2组, 正常饲养, 对照组饮用自来水, 实验组饮用DDW,喂养 6周。
1 . 2 . 2对小鼠免疫器官指数的影响: 上述小鼠培养后, 颈椎脱臼处死, 解剖剥取胸腺和脾脏,称重,计算小鼠胸腺指数和脾指数:胸腺指数=胸腺重 # 1000 /体重脾指数=脾重 # 1000 /体重
1 . 2 . 3对小鼠血清 IgG, Ig M 水平的影响:取上述小鼠, 将其眼眶放血, 分离血清, 分别按试剂盒说明书方法测定 I gG , Ig M 含量。
1 . 2 . 4MTT法测定 ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖功能:无菌取脾, 置于盛有适量无菌 Hanks液的平皿中, 用镊子轻轻将脾撕碎, 制成单细胞悬液。经氨基酸和生物资源 2010 , 34( 3 ) : 59~ 62Am i no Aci d s& B i otic R esources200目筛网过滤,用 H anks液洗 3次,每次 1000 r∃m in- 1离心 10m i n。然后将细胞悬浮于 1mL的完全培养液中,用台盼兰染色 ( 0 . 1 mL 0 . 6%台盼兰 +0 . 1mL1 . 7 % NaC l液+ 0 . 2 mL细胞悬液, 混匀) ,计算细胞存活率(应在 95 %以上) ,调整细胞浓度为每毫升 5 # 105个。将每毫升 5 # 105个脾细胞悬液加入到 96孔培养板中,每孔 200 L ,每孔加 1 L的 Con A液(相当于 5 mg∃ L- 1) , 置 5 % CO2, 37% 培养 72 h , 在培养结束前 4 h , 于培养板各孔内加入 MTT 液 ( 5 g∃L- 1) 10 L /孔,继续培养 4 h。1000 r∃ m i n- 1离心10 m in弃上清,各孔内加入 150 L的 DMSO,溶解10 m in ,用酶标测定仪在波长 490 nm处测 OD值。淋巴细胞的增殖能力用加 ConA孔的光密度值减去不加 ConA孔的光密度值表示。计算刺激指数:刺激指数= OD实验 /OD对照

1 . 2 . 5迟发型变态反应( DTH ) : 取 16只 ICR雄性小鼠, 分组和培养方法同 1 . 2 . 1 ,在饲养第 30 d时,将小鼠腹部去毛,范围为 3 c m # 3 c m, 将 10 g∃ L- 1DNFB 均匀涂抹于上, 隔日加强一次。第 40 d时将10 g∃ L- 1DNFB 均匀涂抹于小鼠右耳进行攻击,使局部产生迟发型变态反应,攻击 24 h后,颈椎脱臼处死小鼠,剪下左右耳壳, 用打孔器取下直径 8 mm的耳片,称取质量, 以左右耳片重量之差做为肿胀度,比较各组的差别。
1 . 2 . 6对小鼠 NK细胞活性的影响: 如上制脾细胞
悬液,取靶细胞和效应细胞各 100 L (效靶比 50︰1) ,加入 U型 96孔培养板中,靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各 100 L , 靶细胞最大释放孔加靶细胞和 2. 5 % Tri t i on各 100 L ; 上述各项均设三个平行孔,置 5 % CO2, 37% 培养 4 h , 然后将 96孔培养板以 1500 r∃min- 1离心 5m in ,每孔吸取上清 100L置平底 96孔培养板中, 同时加入 LDH 基质液100 L ,反应 10m i n ,每孔加入 1mo l ∃ L- 1的HC l 30L,在酶标仪 490 nm处测定 OD值。NK细胞活性 (% ) = &(反应孔 OD - 自然孔OD) / (最大释放孔 OD-自然释放孔) ∋ # 100 %
1 . 2 . 7外周血 T淋巴细胞及其亚群 CD4+和 CD4+/CD8+的变化: 取上述培养小鼠的外周抗凝血,加入PBS液作倍比稀释, 常规分离淋巴细胞。用 PBS将细胞调置每毫升 1 # 106个的浓度待用。取 50 L的细胞悬液置于流式管中, 加入 20 L CD4+和CD8+抗体,避光温室反应 20 m in , PBS洗去上清后,再加入 PBS液 100 L,制成细胞悬液。用未标记的样品作对照,用流式细胞仪检测 T细胞亚群含量。
1 . 3 统计学处理
所有数值均以 均数 ∀标准差 表示,运用 SPSS13 . 0统计软件进行数据分析,组间比较采用 t检验。P < 0 .05作为数理统计差异显著性的评价。
2      结果
2 . 1 细胞免疫
2 . 1 . 1低氘水对小鼠淋巴细胞增殖功能的影响: 用MTT法测定 ConA刺激的小鼠淋巴细胞增殖, 结果表明实验组和对照组 OD值没有显著差异。
2 . 1 . 2低氘水对小鼠迟发型变态反应的影响: 用DNFB攻击小鼠两耳, 结果表明实验组和对照组两耳质量差值没有显著差异。
2 . 1 . 3低氘水对 NK细胞活性的影响:用 LDH法测NK细胞活性,实验组和对照组没有显著差异。

2 . 2 体液免疫
2 . 2 . 1低氘水对小鼠血清中 I gG , Ig M 水平的影响:结果显示低氘水可以显著提高血清中 Ig M 的含量(P < 0 . 01) , IgG的含量有提高但没有统计学意义。
2 . 3非特异性免疫
2 . 3 . 1低氘水对小鼠免疫器官指数的影响: 表 1显示低氘水对脾脏指数有非常显著的提高 ( P <0 . 01) ,对胸腺指数的提高没有显著差异性。
表 1  低氘水对小鼠免疫调节作用研究

2 . 4低氘水对小鼠 T细胞亚群 CD4+和 CD8+变化的影响: 运用流式细胞术对 T细胞亚群的数值进行测量, 如图 1所示, 左上角区域中的点代表 CD4+,左下角区域中红点代表 CD8+, 实验组中 CD4+和CD4+/CD8+的含量显著高于对照组(P < 0 . 05) , 而CD8+的含量则显著低于对照(P < 0 . 05)。∃ 60 ∃ 连璐等:  低氘水对小鼠免疫调节作用的研究图 1 流式细胞术测 T细胞亚群

含a图为对照组, b图为实验组。

3  讨  论
机体的免疫主要分为两个部分, 分别是非特异性免疫和特异性免疫, 而特异性免疫又包括体液免疫和细胞免疫。血清 IgG, I gM是机体体液免疫的分子基础,发挥着特异性免疫的防护作用,同时可激活补体传统途径, 参与机体的非特异性免疫[ 7]。胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官。胸腺是 T淋巴细胞发育分化成熟的场所, 能不断的向外周淋巴器官和组织提供分化成熟的 T淋巴细胞, 维持机体正常的细胞免疫功能, 并影响体液免疫功能。脾脏是机体内最大的免疫器官, 是机体合成和分泌抗体的重要场所。脾脏和胸腺质量的改变可反映出受试物对免疫系统的刺激作用。衡量机体细胞免疫功能的实验有淋巴细胞增殖实验,迟发型变态反应和 NK细胞活性检测。脾淋巴细胞最初由中枢免疫器官迁来, 靠抗原的刺激而增殖, 从而达到增强免疫的作用。迟发型变态反应是由特异性致敏效应 T细胞介导的细胞免疫反应, 其中的 T细胞在移植物排斥, 移植物抗宿主病,自身免疫和肿瘤免疫等方面起着关键作用[ 8]。NK细胞是细胞免疫的非特异性成分, 不需抗原致敏或抗体辅助,就能直接杀伤肿瘤细胞, 处于机体抗肿瘤,抗感染的第一道防线。本实验正是通过上述实验方法, 试图全面分析低氘水对正常小鼠免疫调节作用的影响。结果中脾脏指数( 3 . 93 ∀ 0 . 35)及血清 Ig M ( 1. 10 ∀ 0 . 10)的显著提高(P < 0 . 01)提示低氘水有一定增强免疫力的作用。但在其他指标,特别是细胞免疫的三个指标中, 实验组与对照组均无统计学差异,这可能是因为免疫调节药物对于免疫功能衰竭的动物可取得免疫刺激的效果,但对免疫功能正常者则难以显示免疫增强效应。如益气生津方对正常大鼠 NK活性影响的试验中, 空白水组为 ( 45 . 75 ∀ 13 . 12)% , 而高中低剂量药物组数值分别为 ( 43 . 43 ∀ 7 . 08 )%,( 41 . 24 ∀ 12 . 72)% , ( 41 . 24 ∀ 12 . 72)% , 显示服药对脾 NK 细胞活性影响不显著 (P > 0 . 05)[ 9]。又如, 蛤仔多糖对正常小鼠脾指数的影响没有统计学差异,且低中剂量在胸腺指数的指标上呈现免疫抑制作用 ( 3 . 96 ∀ 0 . 56 ) vs ( 4 . 91 ∀ 0 . 41) ( P <0 . 05)[ 10]。鉴于上述细胞免疫的阴性结果, 本实验深入的对T细胞亚群进行了分析。T淋巴细胞来源于骨髓造血淋巴样干细胞,按其表面分子和功能的不同,可将其分为不同亚群。其CD4+细胞和CD8+细胞是功能相异的 2个亚群, CD4+结合 MHC - !类分子, 而 CD8+结合MHC- (类分子,它们通过细胞间的直接接触或通过释放细胞因子导致或抑制效应,使免疫应答在双向调控下表现出适当的强度。2个亚群细胞比例的失调就会产生免疫功能失常, 正常成年人的 CD4+/CD8+的比值在 1 . 7~ 2. 0之间, 比值的降低可能反映机体易感性一时性的增加。本研究结果显示实验组 CD4+水平显著升高 ( 67 . 69 ∀7 . 83)% (P < 0. 05), CD4+/CD8+比值也升至 ( 2 . 31∀ 0 . 84)% (P < 0 . 05)。这提示低氘水对正常小鼠可能具有增强辅助 TCR识别结合抗原和参与 T细胞活化信号转导的能力, 但在 T细胞增殖, 分化, 转化上的实质性帮助不显著。