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技术介绍

TECHNOLOGY INTRODUCTION 

实验一:贫氘水(超轻水)体外对肿瘤细胞生长抑制的研究

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贫氘水(超轻水)体外对肿瘤细胞生长抑制的研究


1实验材料 
1.1 细胞株
人肝癌细胞株HepG2 、SMMC7721:由上海复蒙生物有限公司提供 。
1.2 受试样品 见表1 

表1 受试样品
编 号 受试样品
1 贫氘水
2 注射用水
3 注射用环磷酰胺+贫氘水
4 注射用环磷酰胺+注射用水

1.3 试剂
四甲基偶氮唑盐(MTT):美国GIBCO公司出品
二甲基亚砜(DMEM):北京索莱宝科技有限公司
DMEM培养基:美国GIBCO公司出品
胰蛋白酶:美国GIBCO公司出品
小牛血清(NBCS):杭州四季青生物工程材料有限公司出品。
青霉素:哈药集团制药总厂 批号:A081100207
链霉素:大连美罗大药厂 批号:65081216
1.4 仪器与设备
CO2培养箱(RCO3000TVBA):美国NUAIRE公司产品
超净工作台(SW-CJ-1F):苏净集团安泰公司
AE31型倒置相差显微镜:Motic公司
SUNRISE酶标仪:瑞士TECAN公司
不锈钢正压滤器(500 mL):海宁市亚泰制药机械有限公司
96孔无菌培养板:美国Costar公司产品
旋转蒸发仪(RE-52AA):上海亚荣生化仪器厂
循环水式真空泵(SHZ-DⅢ):巩义市予华仪器有限责任公司
手提式压力蒸汽消毒器:丹东市日用五金厂
ACCULAB ALC-11C.4型电子天平:德国赛多利斯集团
真空干燥箱(DZF-6020型):上海一恒科学仪器有限公司
血球计数板:上海求精生化仪器厂
1.5 试剂的配制
1.5.1 DMEM培养液配制
  取DMEM培养基干粉1袋,放入1000 mL容量瓶中,倒入三蒸水700 mL,用磁力搅拌器搅拌至全部溶解后,加入NaHCO3 2.0 g、100U•mL-1的青霉素、100μm•mL-1链霉素及56℃水浴灭活的胎牛血清10mL,补加三蒸水至最终体积,再用磁力搅拌器搅拌搅匀。调整培养液的PH值至7.2-7.4。用装有0.22μm和0.45μm的不锈钢无菌微孔滤膜滤器过滤除菌,250 mL分装于无菌玻璃瓶,-20℃冰箱中保存。
1.5.2 磷酸盐缓冲溶液(PBS)
  取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4和3.49 g Na2HPO4•12H2O,加三蒸水1000 mL溶解,调pH7.2-7.4,250 mL分装,用装有0.22μm和0.45μm的不锈钢无菌微孔滤膜滤器过滤除菌,-4℃冰箱保存。
1.5.3 0.25%胰蛋白酶及MTT溶液
取2.5 g胰蛋白酶,加PBS缓冲盐500 mL溶解,调pH 7.2-7.4,装有0.22μm和0.45μm的不锈钢无菌微孔滤膜滤器过滤除菌,20 mL分装,- 20 ℃保存。
MTT溶液:用PBS将MTT配制成5 mg•mL-1(pH 7.4),用0.22μm微孔滤膜过滤除菌,-20 ℃避光保存。
1.6 细胞培养
  人肝癌HepG2细胞株,按常规贴壁细胞培养法接种于含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基中,在温度为37 ℃CO2浓度为5%饱和湿度的条件下常规培养。2天后换液并传代一次,取对数生长期细胞作后续实验。
1.7 分组及给药
对照组:在细胞培养系中加完全培养基100μL。
实验组:在细胞培养系中加入不同浓度的样品溶液,使其终浓度均为2倍量关系。
2实验方法
  取培养2-3天、处于对数生长期的细胞1瓶,经PBS清洗、0.25%的胰酶消化,待细胞变圆后用含10%PBS的DMEM培养基冲洗分散细胞,制成细胞悬液。在细胞计数板上计数,细胞浓度=四大格细胞总数×104/4个/mL;加培养基稀释至浓度为5×104个/mL,接种于96孔培养板,每孔100µL,继续培养约12 h待细胞贴壁完全。设加药孔、空白孔(只加培养基,酶标仪调零用)和对照孔(加细胞,但不加药物),每组设4个复孔。继续培养72 h,每孔加20μL (5 mg.mL-1)MTT,继续培养4 h后吸净孔内上清液,每孔加入150μL DMSO。振荡,至溴代噻唑蓝完全溶解,在492nm波长处用酶标仪测其吸光度(OD),计算药物对细胞的抑制率及IC50。
细胞生长抑制率=(1- OD加药组/ OD对照组)×100%。
3 实验结果
  受试样品培养72后,与对照组相比较,贫氘水对人肝癌肿瘤细胞HepG2、SMMC7721具有一定的生长抑制作用,并随着剂量的增加而增加,并显示出一定量效关系,其中人肝癌肿瘤细胞SMMC7721抑制作用尤为明显,与环磷酰胺作用相当。同时图1-4显示,HepG2、SMMC7721肿瘤细胞培养液中加入贫氘水后培养72h,受试组与对照组比较肿瘤细胞个数明显减少,证实贫氘水具有抑制HepG2细胞增殖的作用。结果见表1。图1-4。

表1 对HepG2的生长抑制试验结果

乌骨藤多糖 浓度(µL) OD值 抑制率%
对照组 0 2.492±0.19 ---
贫氘水 25 2.437±0.45 2.22
贫氘水 50 2.392±0.57 4.01
贫氘水 100 2.160±0.39 13.31
注射用水 100 2.414±0.66 3.11
注射用环磷酰胺+贫氘水 100(含20µg环磷) 2.054±0.22 17.64
注射用环磷酰胺+注射用水 100(含20µg环磷) 2.109±0.41 15.40


表2 对SMMC7721的生长抑制试验结果

乌骨藤多糖 浓度(µL) OD值 抑制率%
对照组 0 0.817±0.021 ---
贫氘水 25 0.488±0.014 40.29
贫氘水 50 0.461±0.037 43.60
贫氘水 100 0.382±0.029 53.27
注射用水 100 0.657±0.048 19.59
注射用环磷酰胺+贫氘水 100(含20µg环磷) 0.449±0.035 45.04
注射用环磷酰胺+注射用水 100(含20µg环磷) 0.441±0.023 46.00



4 讨论 
4.1 试验结果证实,贫氘水对人肝癌HepG2肿瘤细胞的生长具有抑制作用,且呈现一定的量效关系,其抑制人肝癌HepG2肿瘤细胞生长的作用明显优于注射用水,环磷酰胺+贫氘水配伍使用,生长抑制作用与环磷酰胺+注射用水配伍使用结果基本一致,未见明显增加。
4.2 试验结果证实,贫氘水对人肝癌SMMC7721肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用,且呈现明显的量效关系,其抑制作用明显优于注射用水,且强于目前常用抗肿瘤药物环磷酰胺的抑制作用,环磷酰胺+贫氘水配伍使用,对SMMC7721肿瘤细胞的生长抑制作用与环磷酰胺+注射用水配伍使用结果基本一致,未见明显增加。
5 结论
5.1 贫氘水对人肝癌HepG2、SMMC7721肿瘤细胞的生长具有抑制作用,其中对人肝癌SMMC7721肿瘤细胞抑制作用尤为明显,甚至优于常用抗肿瘤药物环磷酰胺的作用(贫氘水抑制率53%,环磷酰胺抑制率45%)。
5.2 贫氘水对人肝癌HepG2、SMMC7721肿瘤细胞的生长具有抑制作用远优于注射用水。
5.3 贫氘水+环磷酰胺联合用药抗肿瘤作用未见明显增加,与注射用水+环磷酰胺联合用药的抑制肿瘤细胞的作用基本一致。